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熒光和熒光壽命
分子包含多個(gè)單能態(tài)S0、S1、S2…和三重態(tài)T1…，每個(gè)能態(tài)都包含多個(gè)精細(xì)的能級(jí)。正常情況下，大部分電子處在*低能態(tài)即基態(tài)S0 的*低能級(jí)上，當(dāng)分子被光束照射，會(huì)吸收光子能量，電子被激發(fā)到更高的能態(tài)S1 或S2 上，在S2 能態(tài)上的電子只能存在很短暫的時(shí)間，便會(huì)通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換過(guò)程躍遷到S1 上，而S1 能態(tài)上的電子亦會(huì)在極短時(shí)間內(nèi)躍遷到S1 的*低能級(jí)上，而這些電子會(huì)存在一段時(shí)間后通過(guò)震蕩弛豫輻射躍遷到基態(tài)，這個(gè)過(guò)程會(huì)釋放一個(gè)光子，即熒光。
此外，亦會(huì)有電子躍遷至三重態(tài)T1 上，再由T1 躍遷至基態(tài)，我們稱之為磷光。
熒光特性
研究熒光特性時(shí)，主要在以下幾方面進(jìn)行分析：激發(fā)光譜，發(fā)射光譜、熒光強(qiáng)度、偏振熒光、熒光發(fā)光量子產(chǎn)率、熒光壽命等。其中熒光壽命（Fluorescence Lifetime）是指熒光分子在激發(fā)態(tài)上存在的平均時(shí)間（納秒量級(jí)）。
熒光壽命測(cè)試
熒光壽命一般在幾納秒至幾百納秒之間，如今主要有兩類測(cè)試方法：時(shí)域測(cè)量和頻域測(cè)量時(shí)間穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)測(cè)試曲線：
1 時(shí)域測(cè)量
由一束窄脈沖將熒光分子激發(fā)至較高能態(tài)S1，接著測(cè)量熒光的發(fā)射幾率隨時(shí)間的變化。其中目前廣泛應(yīng)用的是時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)，即TCSPC(Time Correlated Single Photon Counting)
時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(TCSPC) 實(shí)現(xiàn)了從百ps-ns-us 的瞬態(tài)測(cè)試，此方法對(duì)數(shù)據(jù)的獲取*依賴快速探測(cè)器和高速電路。用統(tǒng)計(jì)的方法計(jì)算樣品受激后發(fā)出的第一個(gè)( 也是*一的一個(gè)) 光子與激發(fā)光之間的時(shí)間差，也就是下圖的START( 激發(fā)時(shí)刻) 與STOP( 發(fā)光時(shí)刻) 的時(shí)間差。由于對(duì)于Stop 信號(hào)的要求，所以TCSPC 一般需要高重復(fù)頻率的光源作為激發(fā)源，其重復(fù)至少要在100KHz 以上，多數(shù)的光源都會(huì)達(dá)到MHz 量級(jí)；同時(shí)，在一般情況下還要對(duì)Stop 信號(hào)做數(shù)量上的控制，做到盡量滿足在一個(gè)激發(fā)周期內(nèi)，樣品產(chǎn)生且只產(chǎn)生一個(gè)光子的有效熒光信號(hào)，避免光子對(duì)的出現(xiàn)。
2 頻域測(cè)量
對(duì)連續(xù)激發(fā)光進(jìn)行振幅調(diào)制后，分子發(fā)出的熒光強(qiáng)度也會(huì)受到振幅調(diào)制，兩個(gè)調(diào)制信號(hào)之間存在與熒光壽命相關(guān)的相位差，因此可以測(cè)量該相位差計(jì)算熒光壽命。
左圖為正弦調(diào)制激發(fā)光（綠色）頻域顯示，發(fā)射光信號(hào)（紅色）相應(yīng)的相位變化頻域顯示。
右圖為對(duì)應(yīng)不同壽命的調(diào)制和相位的頻域顯示。TM- 調(diào)制壽命，TP- 相位壽命。[1]
顯微熒光壽命成像技術(shù)（FLIM）
顯微熒光壽命成像技術(shù)（Fluorescence Lifetime ImagingMicroscopy，F(xiàn)LIM）是一種在顯微尺度下展現(xiàn)熒光壽命空間分布的技術(shù)，由于其不受樣品濃度影響，具有其他熒光成像技術(shù)無(wú)法代替的優(yōu)異性能，目前在生物醫(yī)學(xué)工程、光電半導(dǎo)體材料等領(lǐng)域是一種重要的表征測(cè)量手段。
FLIM 一般分為寬場(chǎng)FLIM 和激光掃描FLIM。
寬場(chǎng)FLIM（Wide Field FLIM,WFM）
該技術(shù)是用平行光照明并由物鏡聚焦樣品獲得熒光信號(hào)，再由一寬場(chǎng)相機(jī)采集熒光成像。寬場(chǎng)FLIM 常用于快速獲取大面積樣品成像。時(shí)域或是頻域壽命采集都可以應(yīng)用在寬場(chǎng)成像FLIM 上。寬場(chǎng)FLIM 有更高幀率和低損傷的優(yōu)勢(shì)。
2 激光掃描FLIM（Laser Scanning FLIM,LSM）
激光掃描FLIM 是針對(duì)選定區(qū)域內(nèi)的樣品逐點(diǎn)獲取其熒光衰減曲線，再經(jīng)過(guò)擬合最終合成熒光壽命圖像。相比寬場(chǎng)FLIM，其在空間分辨率、信噪比方面有更大的優(yōu)勢(shì)。掃描方式有兩種：一種是固定樣品，移動(dòng)激光進(jìn)行掃描，一種是固定激光，電動(dòng)位移臺(tái)帶動(dòng)樣品移動(dòng)進(jìn)行掃描。
超快熒光測(cè)試系統(tǒng)FLIM應(yīng)用
材料科學(xué)領(lǐng)域寬禁帶半導(dǎo)體如GaN、SiC 等體系的少子壽命mapping 測(cè)量
量子點(diǎn)如CdSe@ZnS 等用作熒光壽命成像顯微鏡探針
鈣鈦礦電池/LED 薄膜的組分分析、缺陷檢測(cè)
銅銦鎵硒CIGS，銅鋅錫硫CZTS 薄膜太陽(yáng)能電池的組分、缺陷檢測(cè)
鑭系上轉(zhuǎn)換納米顆粒
GaAs 或GaAsP 量子阱的載流子擴(kuò)散研究
生命科學(xué)領(lǐng)域
細(xì)胞體自身熒光壽命分析
自身熒光相對(duì)熒光標(biāo)記的有效區(qū)分
活細(xì)胞內(nèi)水介質(zhì)的PH 值測(cè)量
局部氧氣濃度測(cè)量
具有相同頻譜性質(zhì)的不同熒光標(biāo)記的區(qū)分
活細(xì)胞內(nèi)鈣濃度測(cè)量
時(shí)間分辨共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）：納米級(jí)尺度上的遠(yuǎn)差測(cè)量，環(huán)境敏感的FRET 探針定量測(cè)量
代謝成像：NAD(P)H 和FAD 胞質(zhì)體的熒光壽命成像
超快熒光測(cè)試系統(tǒng)FLIM應(yīng)用案例
1 用熒光分子對(duì)海拉細(xì)胞進(jìn)行染色
用熒光分子轉(zhuǎn)子Bodipy-C12 對(duì)海拉細(xì)胞（宮頸癌細(xì)胞的一種） 進(jìn)行染色。
(a) 顯微熒光壽命成像圖，壽命范圍1ns（藍(lán)色）到2.5ns（紅色）；
(b) 熒光壽命直方圖，脂肪滴的短壽命約在1.6ns 附近，細(xì)胞中其他位置壽命較長(zhǎng)，在1.8ns 附近。
用熒光分子轉(zhuǎn)子的時(shí)間分辨測(cè)量*大的好處在于熒光壽命具備足夠清晰的標(biāo)簽特性，且與熒光團(tuán)的濃度無(wú)關(guān)。[2]
2 金屬修飾熒光
金屬修飾熒光：
(a) 熒光壽命是熒光團(tuán)到金表面距離的函數(shù)；
(b) 用綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記乳腺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜的共聚焦xz 橫截面，垂直比例尺：5m；
(c) b 圖的FLIM 圖，金表面附近的GFP 熒光壽命縮短。[2]
3 鈣鈦礦太陽(yáng)能電池
下圖研究中，展示了一種動(dòng)態(tài)熱風(fēng)（DHA）制備工藝來(lái)控制全無(wú)機(jī)PSC 的薄膜形態(tài)和穩(wěn)定性，該工藝不含有常規(guī)的有害反溶劑，可以在大氣環(huán)境中制備。同時(shí)，鈣鈦礦摻有鋇（Ba2+） 堿金屬離子（BaI2:CsPbI2Br）。這種DHA 方法有助于形成均勻的晶粒并控制結(jié)晶，從而形成穩(wěn)定的全無(wú)機(jī)PSC。從而在環(huán)境條件下形成完整的黑色相。經(jīng)過(guò)DHA處理的鈣鈦礦光伏器件，在0.09cm小面積下，效率為14.85%，在1x1cm的大面積下，具有13.78%的*高效率。DHA方法制備的器件在300h后仍然保持初始效率的92%。
4 MQWs 多量子阱研究
在(a) 藍(lán)寶石和(b) GaN 上生長(zhǎng)的MQWs 的共焦PL mapping 圖像。具有較小尺寸的發(fā)光團(tuán)的最高密度是觀察到在GaN 上生長(zhǎng)的MQWs。在(c) 藍(lán)寶石和(d)GaN 上生長(zhǎng)的MQWs 的共焦TRPL mapping 圖。僅對(duì)于在GaN 上生長(zhǎng)的MQWs，強(qiáng)的PL 強(qiáng)度區(qū)域與較長(zhǎng)PL 衰減時(shí)間的區(qū)域很好地匹配。在(e) 藍(lán)寶石和(f)GaN 上生長(zhǎng)的MQWs 在A 點(diǎn)和B 點(diǎn)測(cè)量的局部PL 衰減曲線，均標(biāo)記在圖中。對(duì)于在GaN 上生長(zhǎng)的MQWs，點(diǎn)A 和B 之間的PL 衰減時(shí)間差更高。
參數(shù)配置
北京卓立漢光儀器有限公司提供的顯微熒光壽命成像系統(tǒng)是基于顯微和時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)技術(shù)，配合高精度位移臺(tái)得到微觀樣品表面各空間分布點(diǎn)的熒光衰減曲線，再經(jīng)過(guò)用數(shù)據(jù)擬合，得到樣品表面發(fā)光壽命表征的影像。是光電半導(dǎo)體材料、熒光標(biāo)記常用熒光分子等類似熒光壽命大多分布在納秒、幾十、幾百納秒尺度的物質(zhì)的選擇。
參數(shù)指標(biāo)：
系統(tǒng)性能指標(biāo) | |
光譜掃描范圍 | 200-900nm |
最小時(shí)間分辨率 | 16ps |
熒光壽命測(cè)量范圍 | 500ps-1μs@ 皮秒脈沖激光器 |
空間分辨率 | ≤1μm@100X 物鏡@405nm 皮秒脈沖激光器 |
熒光壽命檢測(cè)IRF | ≤2ns |
配置參數(shù) | |
激發(fā)源及匹配光譜范圍 （光源參數(shù)基于 50MHz 重復(fù)頻率） | 375nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：30ps，平均功率1.5mW，熒光波段：400-850nm |
405nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：25ps，平均功率2.5mW，熒光波段：430-920nm | |
450nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：50ps，平均功率1.9mW，熒光波段：485-950nm | |
488nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：70ps，平均功率1.3mW，熒光波段：500-950nm | |
510nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：75ps，平均功率1.1mW，熒光波段：535-950nm | |
635nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：65ps，平均功率4.3mW，熒光波段：670-950nm | |
660nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：60ps，平均功率1.9mW，熒光波段：690-950nm | |
670nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：40ps，平均功率0.8mW，熒光波段：700-950nm | |
科研級(jí)正置顯微鏡 | 落射明暗場(chǎng)鹵素?zé)粽彰鳎?2V，100W 5 孔物鏡轉(zhuǎn)盤，標(biāo)配明場(chǎng)用物鏡：10×，50×，100× 監(jiān)視CCD：高清彩色CMOS 攝像頭，像元尺寸：3.6μm*3.6μm， 有效像素：1280H*1024V，掃描方式：逐行，快門方式：電子快門 |
電動(dòng)位移臺(tái) | 高精度電動(dòng)XY 樣品臺(tái)，行程：75*50mm（120*80mm 可選）， 最小步進(jìn)：50nm，重復(fù)定位精度：＜ 1μm |
光譜儀 | 320mm 焦距影像校正單色儀，雙入口、狹縫出口、CCD 出口， 配置三塊68×68mm 大面積光柵，波長(zhǎng)準(zhǔn)確度：±0.1nm， 波長(zhǎng)重復(fù)性：±0.01nm，掃描步距：0.0025nm，焦面尺寸：30mm(w)×14mm(h)， 狹縫縫寬：0.01-3mm 連續(xù)電動(dòng)可調(diào) |
探測(cè)器：制冷型紫外可見(jiàn)光電倍增管，光譜范圍：185-900nm（標(biāo)配，可擴(kuò)展） | |
光譜CCD （可擴(kuò)展PLmapping） | 低噪音科學(xué)級(jí)光譜CCD（LDC-DD），芯片格式：2000x256， 像元尺寸：15μm*15μ m, 探測(cè)面：30mm*3.8mm，背照式深耗盡芯片， 低暗電流，*低制冷溫度-60℃ @25℃環(huán)境溫度，風(fēng)冷，最高量子效率值>95% |
時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器（TCSPC） | 時(shí)間分辨率：16/32/64/128/256/512/1024ps……33.55μs，死時(shí)間＜ 10ns， *高65535 個(gè)直方圖時(shí)間窗口，瞬時(shí)飽和計(jì)數(shù)率：100Mcps，支持穩(wěn)態(tài)光譜測(cè)試； |
OmniFluo-FM 熒光壽命成像專用軟件 | 控制功能：控制樣品平移臺(tái)移動(dòng)，通過(guò)顯微鏡的明場(chǎng)光學(xué)像定位到合適區(qū)域， 框選掃描區(qū)域進(jìn)行掃描，逐點(diǎn)獲得熒光衰減曲線，實(shí)時(shí)生成熒光圖像等 數(shù)據(jù)處理功能：自動(dòng)對(duì)掃描獲得的FLIM 數(shù)據(jù)，逐點(diǎn)進(jìn)行多組分熒光壽命擬合 （組分?jǐn)?shù)小于等于4），對(duì)逐點(diǎn)擬合獲得的熒光強(qiáng)度、熒光壽命等信息生成 偽彩色圖像顯示 圖像處理功能：直方圖、色表、等高線、截線分析、3D 顯示等 |
操作電腦 | 品牌操作電腦，Windows 10 操作系統(tǒng) |
軟件界面
控制測(cè)試界面
測(cè)試軟件的界面遵循“All In One"的簡(jiǎn)潔設(shè)計(jì)思路，用戶可在下圖所示的控制界面中完成采集數(shù)據(jù)的所有步驟：包括控制樣品平移臺(tái)移動(dòng)，通過(guò)顯微鏡的明場(chǎng)光學(xué)像定位到合適區(qū)域，框選掃描區(qū)域進(jìn)行掃描，逐點(diǎn)獲得熒光衰減曲線，實(shí)時(shí)生成熒光圖像等。
數(shù)據(jù)處理界面
功能豐富的熒光壽命數(shù)據(jù)處理軟件，充分挖掘用戶數(shù)據(jù)中的寶貴信息?？勺詣?dòng)對(duì)掃描獲得的FLIM 數(shù)據(jù)，逐點(diǎn)進(jìn)行多組分熒光壽命擬合（組分?jǐn)?shù)小于等于4），對(duì)逐點(diǎn)擬合獲得的熒光強(qiáng)度、熒光壽命等信息生成偽彩色圖像顯示。
自主開發(fā)的一套時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）熒光壽命的擬合算法，可對(duì)熒光衰減曲線中最多包含4 個(gè)時(shí)間組分的熒光過(guò)程進(jìn)行擬合，獲得每個(gè)組分的熒光壽命，光子數(shù)比例，計(jì)算評(píng)價(jià)函數(shù)和殘差。TCSPC 熒光壽命通常并非簡(jiǎn)單的指數(shù)衰減過(guò)程，而是與光源及探測(cè)器相關(guān)的儀器響應(yīng)函數(shù)（IRF）與熒光衰減過(guò)程相互卷積的結(jié)果，因此適當(dāng)?shù)臄M合方法和參數(shù)選擇對(duì)獲得正確可靠的熒光壽命非常重要。該軟件可導(dǎo)入實(shí)際測(cè)量的IRF 對(duì)衰減曲線進(jìn)行卷積計(jì)算和擬合。但是大多數(shù)情況下， IRF 很難正確的從實(shí)驗(yàn)獲得，針對(duì)這種情況，軟件提供了兩種無(wú)需實(shí)驗(yàn)獲取IRF 的擬合方法：
1.通過(guò)算法對(duì)數(shù)據(jù)上升沿進(jìn)行擬合，獲得時(shí)間響應(yīng)函數(shù)IRF，然后對(duì)整條衰減曲線進(jìn)行卷積計(jì)算和擬合得到熒光壽命。
2.對(duì)于衰減時(shí)間遠(yuǎn)長(zhǎng)于儀器響應(yīng)時(shí)間的，可對(duì)衰減曲線下降沿進(jìn)行直接的指數(shù)擬合。該軟件經(jīng)過(guò)大量測(cè)試，可以很好的滿足各種場(chǎng)合的用戶需求。
MicroLED 微盤的熒光強(qiáng)度像（3D 顯示）：
測(cè)試案例
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